背景：本文作者结合单细胞转录组学、空间转录组学(ST)和单细胞分辨率多路蛋白成像技术(MIBI)，对人皮肤鳞状细胞癌(cSCCs)组织及与之匹配的正常皮肤组织进行各类分析，确定了肿瘤特异性角化细胞群以及肿瘤前沿部位的免疫浸润和异质性。

　　首先，作者使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)对10对肿瘤-正常皮肤组织的48164个细胞进行鉴定，聚类分析得到cSCC图谱。

　　更进一步，作者对正常上皮细胞重新聚类后，在其中观察到三个主要的角化细胞(KC)亚群，包括基底细胞、循环细胞和分化细胞。肿瘤KC群也涵盖了上述三种细胞类型，但特异性产生了第四个主要的KC亚群，在正常皮肤组织中没有明确的相关性。尽管该亚群与正常KC具有相同的标记基因，但在转录水平表达上有所不同，将其命名为肿瘤特异性角化细胞亚群(TSK)，经过对其一系列分析表明，cSCC表皮失调的关键可能在于TSK(表达EMT，参与上皮-间充质的转化)亚群的出现，基底细胞快速增殖，并未能充分参与分化。

　　接下来，作者对4个病人的12张切片进行空间转录组分析(点直径100µm，间距150µm)，同样得到了一个清晰的TSK亚群，且证明80%的TSK高簇位于肿瘤前缘位置，结合免疫组织化学进一步支持肿瘤基底细胞和TSK细胞在肿瘤前缘的存在。进行更高分辨率空间转录组(2个病人，共4张切片，点直径55µm，间距100µm)，进一步表明肿瘤前缘部分的异质性，支持了TSK细胞周围的纤维血管生态位。

　　为了探究不同细胞类型如何影响cSCC的免疫活性，作者们对已知免疫抑制基因的表达进行了分析。结合scRNA-seq数据和ST数据，表明机体通过诱导树突状细胞和衰竭T细胞的共抑制，并增殖调节性T细胞来参与免疫抑制。

　　MIBI(多路复用离子束成像)技术是一种高维成像技术，该技术依赖金属标记的抗体，大大减少了荧光成像固有的溢出问题，同时为多达40个标记物进行多重成像(IONpath, Inc. MIBIscope™系统)。作者利用MIBI技术对6例患者的18个视野的肿瘤区域进行检测，聚类分析了与scRNA-seq相似的主要细胞类型，基质和免疫成分在肿瘤内部和肿瘤之间是可变的。通过对肿瘤微环境(TME)的空间分析，表明了肿瘤浸润或排斥情况。

　　接着，作者整合scRNA-seq和ST数据集，以表征肿瘤前缘与肿瘤微环境(TME)细胞之间的信号转导。表明TSK亚群细胞参与广泛的自分泌和旁分泌相互作用，主要与CAFs细胞、内皮细胞、巨噬细胞等。

　　肿瘤亚群基因的功能评估需要一个具有代表性的人体cSCC实验模型。为了解决这一问题，作者在免疫缺陷小鼠中用人鳞状细胞癌株生成肿瘤，并进行scRNA-seq。聚类分析支持了4个患者源性亚群的再现。对体外培养的鳞状细胞癌细胞系进行分析，发现其异质性要小的多，这与肿瘤细胞群出现的微环境要求一致。因此，认为该异种移植模型概况了cSCC肿瘤内部异质性的关键特征。此外通过对CRISPR/Cas9筛选三个鳞状细胞癌移植瘤株，评估了肿瘤KC亚群的功能作用，并绘制了致瘤功能的关键基因网络。。

　　总结一下，作者使用scRNA-seq构建了cSCC细胞亚群的单细胞转录组图谱，并与空间转录组和MIBI集成空间图谱来评估这些细胞所处的微环境。