发表载体：Frontiers in Microbiology 影响因子：4.2

　　作者单位： 美国新泽西州凯尼尔沃思，默克公司传染病和疫苗部

　　研究背景：

　　超过90%的HIV-1原病毒被认为是有缺陷的，不能进行病毒复制。虽然有复制能力的原病毒是疾病进展或传播的主要问题，但研究表明，即使有缺陷的原病毒也不是沉默的，可以产生病毒蛋白，这可能会发生炎症和免疫反应。因此，为了了解病毒蛋白对HIV-1发病机制的贡献，并确定HIV-1治愈干预措施的有效性，需要对复制能力前病毒和缺陷前病毒进行敏感的定量分析。此前，我们已报道了一种改进的HIV-1 gag p24数字酶联免疫吸附试验，利用单分子阵列(Simoa)检测细胞相关病毒蛋白。但对低含量分析物的灵敏检测仍存在挑战，并可能存在生物生理样本类型中实际分析物浓度的漏报，例如，样品基质的浓度和粘度会干扰分析信号的产生。本文报道了一种新的p24蛋白富集方法与数字免疫分析相结合，进一步扩大了病毒蛋白检测的灵敏度和特异性。

　　研究目的：改进一种新方法克服检测时大量细胞裂解液中的浓缩基质蛋白与过度稀释的分析液之间的平衡问题，使其允许更大的细胞输入数量，同时最大限度地减少基质效应，以便从生物样本中敏感和特异性地测量p24蛋白。

　　实验方法：

　　免疫沉淀法(IP)：从样品在37◦C水浴中解冻，20000×g旋转10分钟以清除细胞碎片。4微克抗体偶联珠{40µL珠用1 mL珠状洗涤液[PBS + 0.5%牛血清白蛋白(BSA)]洗1次，然后加入}到澄清的上清中。在灭活的CM和以上细胞裂解液上清中加入等体积的3% BSA/PBS，最终得到0.5%的IP混合物中的Triton X-100。IP混合物在4◦C下轻轻摇晃过夜。第二天早上，取下上清液，用1ml珠子洗涤缓冲液清洗珠子两次。用100µL 0.1%三氟乙酸(TFA)洗脱缓冲液在37◦C水浴混合30 min后洗脱结合的p24蛋白。收集洗脱液，用100µL的Simoa裂解缓冲液混合洗涤1次，将p24残留洗脱液与初始洗脱液联合使用，以最大限度地提高回收率，减少非特异性结合，中和后续测量的pH值。在p24 Simoa实验前，重复20,000×g 5 min，用磁铁收集上清，以确保IP(2.8µm直径)中没有珠子带入洗脱液，以减少对Simoa实验的潜在干扰。

　　蛋白检测方法：使用p24 Simoa试剂盒在Quanterix HD-X平台上测量的p24蛋白含量

　　结果讨论：

　　1. p24 IP法的开发与优化

　　通过比较免疫效率和回收率选择IP条件为：选用Capricorn抗p24抗体偶联珠，40µL的10mg /mL抗体珠溶液，0.1% TFA洗脱液，夜间孵育(16-24小时)作为p24捕获的最佳时间。

　　图1 Simoa免疫沉淀(IP)方法的优化。A. IP捕获抗体的选择。使用不同来源的抗体，偶联到磁珠上，p24的回收显示，Capricorn抗体的捕获效果最好，释放和体积调整后的输入浓度相似; B. p24 IP珠粒浓度的优化; C. 洗脱缓冲选择; D. p24 IP捕获所需时间。

　　2. 捕获低p24浓度试验验证

　　为了评估我们的新IP程序是否能够提高检测灵敏度，并在p24浓度较低的情况下保持高回收率，我们在标准曲线的三个最低浓度(0.011、0.024和0.085 pg/mL)下进行了蛋白免疫捕获。

　　与非IP条件相比，IP条件下p24的测量值更高，且与IP程序体积减少3倍成正比，表明即使在很低的分析物浓度下也能从裂解物中几乎完全回收p24。通过评估重复测量中检测的蛋白质标准物的变异系数(CV)来确定分析重复性，发现它们非常一致。这些发现证实了免疫沉淀捕获方法是一种强大的方法，可以在细胞裂解液中回收少量的分析物，且重现性高，并显示了从复杂基质(如细胞和组织裂解液)中富集p24的潜力。

　　图2 捕获低p24浓度。A. IP后最低浓度的重组p24标准曲线完全恢复，B直接Simoa和IP-Simoa样品体积归一化后p24浓度匹配;C. IP-Simoa检测下限为(LOD)≤0.005 pg/mL，定义为每个p24标准的变异系数(CV) <20%。这相当于1fg的p24从给定体积中浓缩，释放为200µL用于检测。

　　3. ART抑制HIV+ CD4+T细胞中p24的检测

　　受ART抑制的HIV+个体的外周血CD4+ T细胞中，翻译能力强的HIV原病毒的发病率非常低，这给定量病毒蛋白表达带来了挑战。为了进一步评估我们新方法的性能，我们激活了来自ART抑制HIV+个体的外周血CD4+ T细胞，并通过IP-Simoa定量p24蛋白的产生。

　　在优化的条件下， IP Simoa成功地检测到来自ART抑制的p24蛋白，HIV阳性供体细胞在体外被刺激以激活潜伏病毒。通过这些，在富集后测量p24，其水平显著高于未富集的裂解液和未感染的对照。这些发现表明，该方法具有特异性，可以检测来自各种不同供体的p24。该实验不仅对研究抑制供体对刺激反应强烈的p24有价值，而且对弱诱导供体也有价值。

　　图3. HIV+、ART抑制的外周血CD4+ T细胞中p24的检测。A. CD4+ T细胞经抗CD3 /抗CD28珠粒刺激3天后产生p24 (n = 3个独立实验，p < 0.05);B.从对刺激反应良好的样本中，p24在5个可诱导供体中按体积减少的比例富集(p < 0.01)，IP后在他们的流量中未观察到p24; C.从刺激后p24产量不高的样品中，IP富集能够证明p24确实产生了，但在没有富集的情况下没有达到检测限。; D. 5个供体中3个CD4+ T细胞(4 × 106个/条件)用1µM VOR处理3天后检测p24蛋白。p24 IP后信号显著富集，细胞裂解液体积减少4倍(p < 0.01)。未受刺激的细胞中未检测到p24;E. 用杀伤集中的方法模拟应用，当将1µM staurosporine加入抗cd3 /抗cd28珠粒刺激这三个诱导供体时，未检测到p24 (p < 0.001).

　　4. 直肠捏活检p24的测量

　　因为淋巴组织是持续感染HIV细胞的蓄水池，我们评估了来自ART抑制的，HIV+个体的IP-Simoa在肠道相关淋巴组织中的p24测量。

　　我们发现直肠组织裂解液基质对重组p24的捕获和检测没有不利影响，而且来自供体来源的样本也可以检测到p24。使用从有病毒血症的供体的直肠掐活检分离出来的细胞，即使在没有IP的情况下，p24被很好地检测到，IP使体积浓度增加了约10倍;信号随稀释度线性下降。这表明直肠活检回收的p24是可以有效测量的。

　　图5 直肠穿刺活检p24蛋白检测。(A)将重组p24分别以0.02 pg/mL和0.1 pg/mL加入活组织切片裂解液，其回收率与IP浓度后从缓冲液中提取基质的回收率相当;(B)当使用从病毒供体来源的样本中回收的p24蛋白作为棘突蛋白来源时，缓冲液和未感染的直肠裂解液基质之间的回收率具有可比性;(C)从感染病毒的直肠活检中分离的细胞被裂解并在标准p24 Simoa或IP-Simoa中运行。p24在IP期间体积减少而富集，稀释后显示线性信号，支持信号特异性;(D)裂解后对p24的直肠活检再处理(n = 3)显示，单个提取产生了活检中96%的p24。IP后溶液中未检测到p24，表明p24完全捕获到珠上;(E)比较HIV阴性和阳性的CD4蛋白，ART抑制的直肠活检显示CD4水平无显著差异，说明各组CD4+细胞存在并裂解的数量相似;(F)使用与(E)相同的裂解液，p24在IP-Simoa后的几个HIV+供者活检样本(9个中的5个)中可以测量，而在HIV阴性供者的活检中却不能测量。

　　5. SIV p27蛋白的IP-Simoa检测方法

　　非人类灵长类动物SIV模型是研究艾滋病治愈的一个重要模型。SIV gag p27蛋白是SIV持久性的相关病毒生物标志物。我们试图确定IP-Simoa p24试验是否适用于SIV p27。

　　结果显示大部分p27在免疫捕获部分被检测到，而p27在流经部分几乎没有检测到。因此，新的IP-Simoa方法适用于SIV gag p27和HIV gag p24蛋白的灵敏检测。

　　图6 IP-Simoa法检测SIV p27蛋白。A. SIV p27 Simoa检测标准曲线。重组p27从0到28 pg/mL的线性信号响应;B. 重组p27加入未感染的恒猴直肠活检组织(通过裂解缓冲液浸泡制备)，并与IP Simoa运行显示富集的p27信号与样品体积减少成比例(20倍)，稀释后信号预期会减少，这表明检测的特异性;C. p27从病毒、SIV+猴子直肠活检的裂解液中显著富集(p < 0.05, n = 4)。IP后的血流中未检测到p27，这表明从活检裂解液基质中提取p27的效率很高。

　　实验结论：总之，我们已经开发出了新颖、特异、敏感的IP-Simoa p24和p27联合免疫检测方法。目前已经在HIV阴性供体、HIV阳性供体的体外重新激活的CD4+ T细胞、病毒血症患者以及非人类灵长类动物的直肠活检中得到验证。这将使对不同供者的更广泛探索成为可能，以帮助确保新疗法的广泛覆盖。