背景介绍：

　　白血病，是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发病率和死亡率均较高，位列我国恶性肿瘤死亡率第6位。急性髓系白血病(AML)是成年人最常见的急性白血病，不同患者预后差异很大，基因表达模式复杂，异质性大。单细胞测序分析，为研究疾病细胞异质性提供了新策略。

　　对40例初发AML患者的骨髓细胞样本进行Microwell-seq高通量单细胞测序分析，分析了191727个单细胞转录组数据，系统性地绘制了AML图谱，为目前最大规模的AML单细胞图谱。

　　结果

　　1、正常BMMC(骨髓单个核细胞)层次分析

　　在三个健康的供体上使用Microwell-seq，构建了8561个正常BMMC的t-SNE图。

　　为了进行谱系轨迹分析，我们整合了我们先前研究中的另外2000个造血干/祖细胞(HSPC)和2719个外周血单个核细胞(PBMC)，总共获得了13280个健康细胞。使用PAGA，我们揭示了不同的发育分支，并建立了正常人的造血功能转录环境。

　　2、识别新生AML的祖细胞簇

　　对40名新诊断的AML患者进行Microwell-seq分析。与健康骨髓相比，AML细胞组的区别较小。在来自不同患者的单细胞数据中，存在明显的转录组变异和缺乏细胞簇边界是最常见的表型。AML单元格局包含20个群集。正常和AML BMMC共享中性粒细胞，单核细胞，红系细胞和淋巴样细胞的簇。但是在其中心有一个无功能的制造基因簇。

　　遗传网络证明，该簇具有与髓样细胞，和相关的分析表明一个相似HSPC。因此，我们将其命名为AML祖细胞簇。与正常细胞不同，AML祖细胞簇不能与任何正常的人类造血或非造血细胞相匹配。

　　3、表征AML祖细胞簇的单细胞基因表达模式

　　与髓样细胞相比，AML祖细胞和HSPC具有许多共同上调的基因，尤其是核糖体蛋白(RP)基因。

　　基因表达模式表明，AML祖细胞处于从HSPC到分化髓样细胞的中间状态。具体而言，AML祖细胞中GATA2，SPI1(PU.1)和MPO的表达水平处于中间水平。 GATA2和SPI1(PU.1)是造血发育的关键基因，MPO是髓样标记基因。但是，一些涉及原始状态的基因在AML祖细胞中表达最高，例如SOX4，FOS和ITM2A。此外，CD99，CFD，RACK1，FTL，B2M和ADA在AML祖细胞簇中过表达，以前的研究发现这些基因与AML之间存在关联。 AML祖细胞还高表达基因，例如TMSB10，SH3BGRL3，MGST1，MRPL33和MARCKSL1，它们与实体瘤相关，但以前未在AML中报道。

　　4、AML祖细胞的肿瘤内异质性可预测预后

　　我们细分了常见的AML祖细胞簇，以表征潜在的异质性。根据顶部标记基因，我们将AML祖细胞簇聚集为16个簇，并将它们概括为四组。 C1、2、3、4和11是RP基因高簇。 其余包括嗜中性粒细胞样，单核细胞样和髓样细胞样簇。

　　我们随后调查了特定簇的细胞比例是否可预测预后。踪了25例IA作为第一方案的患者。其中，有18例患者在第一个疗程后缓解。18例患者中有16例的AML祖细胞主要分布在嗜中性粒细胞样，单核细胞样和髓样细胞样簇中。25例中有7例在第一个疗程后没有缓解。这七个患者的四个AML祖细胞大多在RP基因高簇。总之，我们发现AML祖细胞中RPs的高表达水平是预后不良的预测因素，为AML分类提供了新的视角。

　　5、从诊断到复发，AML祖细胞的临床意义

　　白血病细胞的细胞层次从诊断到复发。我们将Microwell-seq应用于治疗方案之前和之后的四个人。结果表明特定基因，特别是RP基因的表达水平可用于评估肿瘤进展。这也证明Microwell-seq是评估疗效的有用工具。

　　6、通过单细胞水平的SMRT测序将遗传突变与细胞等级联系起来

　　由于覆盖范围的限制，3'单细胞转录组分析未能鉴定出白血病的关键突变。因此，我们将长时间阅读测序与Microwell-seq实验整合在一起。我们使用了有针对性的上游引物和通用下游引物，从单细胞cDNA AMPLIFY特定基因测序SMRT，这样我们就可以得到的突变位点和电池条形码。

　　我们选择了线粒体基因MT-ND4，使用SMRT测序进行谱系追踪。我们从患者P25，P10和P17的单个细胞中鉴定了MT-ND4的异质变体。

　　基于我们对不同患者共享AML祖细胞阶段和不同MT突变细胞克隆之间共享单细胞转录组状态的观察，我们提出了“癌吸引子”的存在。图6df显示与P25患者的HSPC相比，AML祖细胞(D)，AML(E)和正常(F)髓样细胞的吸引子网络的核心基因。

　　讨论：

　　在我们的研究中，我们发现AML祖细胞的特征是多个RP基因的高表达水平，这些基因参与了p53途径。转录组的失调可能导致缓解失败。

　　一代测序和靶向的长读测序的结合能够在单细胞水平上鉴定突变。在本研究中，SMRT测序与Microwell-seq结合使用，从而可以检测到条形码突变并与细胞转录组相关。

　　结论：

　　在我们的研究中，我们使用Microwell-seq分析了40位AML患者的191727个细胞，以建立单细胞AML格局。我们鉴定了具有新型AML标记物的恶性AML祖细胞簇。RP高祖细胞患者的缓解率低。根据AML的情况，我们推导了两种类型的AML，它们具有不同的临床结果。我们表明，单细胞分析可用于预测和评估治疗效果。最后，通过将Microwell-seq与SMRT测序相结合，我们在AML环境中追踪了线粒体突变，并证明了AML克隆与转录组表型之间缺乏关联。我们的结果表明，表型“癌吸引子”的存在可能有助于定义AML祖细胞的常见表型。