一、什么是慢性白血病?

　　慢性白血病是一组起病较隐匿、病程进展缓慢、外周血和(或)骨髓出现幼稚细胞增多但分化相对较好的血液系统恶性疾病。自然病程较急性白血病长，白血病细胞有一定的分化成熟能力，骨髓及外周血以异常的较成熟细胞为主。

　　二、单细胞转录组测序的优势

　　由于测序技术的飞速进展，单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术能够揭示肿瘤微环境在疾病进展和耐药性中的作用，它可以分析单个细胞内的转录体，促进在时间和空间上复杂的细胞群克隆异质性的研宄。

　　三、如何在慢性白血病上开展单细胞转录组分析?

　　1、外周血单核细胞(PBMC)单细胞悬液制备

　　1.1试剂准备：

　　细胞重悬液(10%FBS的IMDM);2X细胞冻存液(30%DMSO，40%FBS的IMDM)。

　　1.2取3ml的Histopaque-1077分离液，放入淋巴细胞分离管中的底部。

　　1.3吸3ml全血，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使血液置于分层液上，保持两者界面清晰。2400rpm(1000g)室温离心10min。

　　PBMC分离示意图

　　1.4离心后，先吸取最上层的血浆至新的EP管中，可用于cfDNA提取，然后用另一只毛细吸管(或1ml注射器)收集血浆和淋巴细胞分离液交界面的单核细胞层，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆(见示意图)。

　　1.5再次2400rpm，离心3min后，弃上清，加入500ul DPBS混匀至15ml离心管中，加入1.5ml红细胞裂解试剂，混匀，室温放置9min以上，对于溶血的样本，裂红9min时间不够，1000rpm离心3min。

　　1.6吸弃上清，加入500ul 1XDPBS(洗液)清洗细胞两次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。

　　1.7 10ml外周血中约含有5-10*106个PBMC，按照5-10*106cells/0.5ml=104cells/ul。加入500ul的细胞重悬液，重悬PBMC，转移至新的低吸附EP管中，取2ul细胞悬液+8ul细胞重悬液，加10ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行细胞计数。以1000rpm，4度离心10分钟。

　　1.8离心之后加入所需的细胞冻存液，放置于冰上。取需要用的冻存管，放于冰上。

　　1.9加入预冷的2X细胞冻存液，混匀，终浓度为10*106cells/ul。

　　1.10取1ml悬液放于1支冻存管中，使得10*106cells/支。放于预冷的冻存盒中，将冻存盒放于-80冰箱至少4h，4h后，放于液氮中保存。

　　2、细胞复苏及细胞活性测定。

　　2.1准备：37℃水浴锅预热，预热10%FBS的IMDM，0.04%BSA(400ug/ml)，1XPBS生长培养基。

　　2.2将细胞冻存管放于37℃水浴锅中2-3min，不要让水面完全没过冻存管，当还有一点冰时，取出，用70%酒精消毒整个冻存管。

　　2.3将冻存管的细胞转移到50ml离心管中，加入1ml预热好的生长培养基，边滴边振荡。

　　2.4等体积，连续稀释5次，每次间隔1min，最终体积为10ml。

　　2.5移除上清至另一离心管中，用普通枪头重悬细胞。备注：保留上清至实验结束。

　　2.6 加1ml生长培养基，轻柔吹打混匀。

　　2.7取10ul细胞悬液加10ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行细胞计数，细胞活性要求大于80%，最好在90%。

　　3、在单细胞平台上分选细胞、转录组文库构建及单细胞测序。

　　四、血液样本的保存及寄送

　　1、一般建议自己在用EDTA紫色抗凝管采集全血后立即分离PBMC，然后当场上机。

　　2、若是要进行寄送，请用EDTA紫色抗凝管抽取全血后，立即送往公司，时间不能够超过12个小时，运输时温度控制在2-8℃。

　　注意：直接寄送全血，后期在分离PBMC会遇到很多问题，即便是分离成功结团率细胞活性也会偏低，不利于后期的数据分析。

　　3、若是不能够在12小时内寄达公司也不能当场上机的话，请老师自行分离PBMC后，采取梯度降温冷冻的方式———4℃ → -20℃ → -80℃梯度降温冻存细胞。保存条件-80℃，干冰寄送。寄往公司后会在37℃恒温水浴锅中复苏，进行后续实验。

　　小科普

　　采血管的区分：

　　1.蓝色头盖管(含有柠檬酸钠抗凝剂的采血管)

　　2.黑色头盖管(含有0.109mol/L柠檬酸钠)

　　3.紫色头盖管(含有乙二胺四乙酸以及其盐的采血管)-常用

　　4.绿色头盖管(肝素抗凝管) 

　　5.灰色头盖管(含有草酸钾/氟化钠) 

　　6.橘红色头盖管(促凝管) 

　　7.金黄色头盖管(含有惰性分离胶及促凝剂的采血管)

　　8.红色头盖管(无添加剂的干燥真空管)