一、腺相关病毒AAV介绍

　　腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvoviridae)家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，由蛋白衣壳(capside)和长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的末端反向重复序列(inverted terminal repeat, ITR)。这两个ITRs是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。AAV基因组中的rep基因编码4个与病毒复制相关的蛋白，分别为Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

　　目前的科学界共识是它不会导致任何人类疾病，研究中采用的重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus, rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。

　　作为基因疗法载体的重组腺相关病毒(rAAV)携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分完全被删除，取而代之的是治疗性转基因(transgene)。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。

　　二、rAAV 包装纯化及滴度检测

　　AAV包装过程中，包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列(ITR，对于病毒的复制和包装具有决定性作用)，辅助质粒包含AAV包装所需的cap(编码病毒衣壳蛋白)和rep(参与病毒的复制)基因，以及腺病毒Helper质粒。三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装。上海和元腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程，采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。另外，我们也可以根据使用者要求，提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml，完全可以满足各类整体实验的使用要求。

　　滴度检测方法：目前主要以定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数实现。

　　滴度检测原理：腺相关病毒的基因组为单链DNA，外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

　　三、rAAV侵染细胞过程

　　纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。

　　四、rAAV载体优势

　　1. 安全性高、免疫原性低：AAV 是一种复制缺陷型DNA病毒，无自主复制能力，野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合，rAAV不整合。目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道，也是FDA批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。

　　2. 宿主细胞范围广：AAV具有广泛的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

　　3. 扩散能力强：AAV直径约20-26nm，体积小，滴度高，具有良好的扩散能力，其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。

　　4. 体内表达基因时间长：AAV具有保持长期基因转录表达能力，体内表达一般3周可以达到高峰，随后持续高表达，作用时间>5个月。

　　5. 种类多样：AAV血清型众多，此外，根据不同的实验设计，还在不断的突变，筛选新的血清型(AAV1-13，AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…)。

　　基于上述特点，AAV被视为是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中，与其他常用病毒工具载体相比，AAV具有感染过程温和长效的表达能力，是基因操作的利器。

　　五、数字PCR定量AAV病毒载体的必要性

　　包装后的AAV病毒产品，首先需要通过超速离心等方法进行纯化AAV病毒，然后定量AAV病毒滴度/拷贝数，但是纯化后的AAV病毒仍然存在大量游离质粒，首先需要用DNA酶消化处理，降低游离质粒对AAV定量的影响;两外，AAV病毒无包膜，定量不需要核酸抽提，直接用AAV粗品/处理品进行定量;

　　因此，AAV包装产品有大量酶、核酸和蛋白等极大干扰qPCR准确定量的干扰因素，导致qPCR定量AAV批次间/批次差异大，不能满足基因治疗产品批次/批件稳定性要求。

　　AAV定量急需一种定量误差小、定量准确的方法，据调研，数字PCR技术的准确定量已经成为AAV病毒滴度检测的业内共识。非常有必要开发dPCR定量AAV方法。

　　数字PCR定量AAV优势：

　　l 无需标准品的绝对定量技术，减少试验操作;

　　l 抗干扰能力强，抵抗AAV粗品中酶和蛋白等抑制因素，保证批次/批间稳定性;

　　l 检测准确性高。

　　定量原理：

　　l 定量插入基因(需要根据不同客户设计，没有共性)。实验设计简单，市场小。

　　l 定量ITR(针对所有AAV产品，均适用)。实验难度大，市场大。